大黄附子汤对重症急性胰腺炎小鼠肠道微皱褶细胞变化的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2022.03.008

中华卫生应急电子杂志 ›› 2022, Vol. 08 ›› Issue (03) : 167 -173. doi: 10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2022.03.008

论著

大黄附子汤对重症急性胰腺炎小鼠肠道微皱褶细胞变化的影响

宋轶¹, 赵伟彤², 路晓光¹^,^†(

), 战丽彬³, 陈海铭⁴, 路童⁴, 康新⁵, 芮庆林⁶

^1. 116001　辽宁大连，大连大学附属中山医院急诊医学科
^2. 563003　贵州遵义，遵义医科大学研究生院
^3. 110847　辽宁沈阳，辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心
^4. 110847　辽宁沈阳，辽宁中医药大学附属医院急诊医学科
^5. 510900　广东广州，南方医科大学第五附属医院急诊医学科
^6. 210004　江苏南京，江苏省中医院急诊医学科

收稿日期:2022-04-13 出版日期:2022-06-18
通信作者: 路晓光
基金资助:
国家自然科学基金(81673801；81473512)

Effect of Da-Huang-Fu-Zi-Tang on changes of intestinal microfold cells in mice with SAP

Yi Song¹, Weitong Zhao², Xiaoguang Lu¹^,^†(), Libin Zhan³, Haiming Chen⁴, Tong Lu⁴, Xin Kang⁵, Qinglin Rui⁶

^1. Department of Emergency Medicine, the Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, China
^2. Graduate School of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China
^3. Innovation Engineering and Technology Center of Traditional Chinese Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China
^4. Department of Emergency Medicine, the Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China
^5. Department of Emergency Medicine, the Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510900, China
^6. Department of Emergency Medicine, Jiangsu Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210004, China

Received:2022-04-13 Published:2022-06-18
Corresponding author: Xiaoguang Lu

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引用本文：

宋轶, 赵伟彤, 路晓光, 战丽彬, 陈海铭, 路童, 康新, 芮庆林. 大黄附子汤对重症急性胰腺炎小鼠肠道微皱褶细胞变化的影响[J]. 中华卫生应急电子杂志, 2022, 08(03): 167-173.

Yi Song, Weitong Zhao, Xiaoguang Lu, Libin Zhan, Haiming Chen, Tong Lu, Xin Kang, Qinglin Rui. Effect of Da-Huang-Fu-Zi-Tang on changes of intestinal microfold cells in mice with SAP[J]. Chinese Journal of Hygiene Rescue(Electronic Edition), 2022, 08(03): 167-173.

目的

研究大黄附子汤对重症急性胰腺炎(SAP)小鼠肠道微皱褶细胞(M细胞)变化的影响，为大黄附子汤临床防治SAP提供理论基础。

方法

选取40只健康SPF级C57BL/6J雄性小鼠，随机分为4组(每组10只)：空白对照组、大黄附子汤对照组、SAP组、大黄附子汤治疗组，其中SAP组和大黄附子汤治疗组分别以3.5 g/kg剂量腹腔注射20% L-精氨酸，空白对照组和大黄附子汤对照组注射等剂量的等渗盐水；于造模后12、24、36 h，空白对照组和SAP组给予等渗盐水0.2 mL，大黄附子汤对照组和治疗组给予大黄附子汤0.2 mL灌肠，均于造模完成48 h后处死取材，使用ELISA检测血清淀粉酶、内毒素、IL-1β及TNF-α含量，取回肠及胰腺组织行HE染色、评分，免疫组化染色检测M细胞特异性蛋白GP2并评分。

结果

(1)一般情况：对照组腹腔注射后小鼠一般情况好，精神状态良好，能正常进水，四肢活动自如，行动未受影响；SAP组小鼠腹腔注射后一般情况差，精神萎靡，反应迟钝，行动迟缓，呼吸急促，拱背收腹，饮水减少。(2)SAP组淀粉酶、内毒素、IL-1β及TNF-α水平较对照组明显升高(P<0.05)；与SAP组进行对比，大黄附子汤治疗组血清淀粉酶、内毒素、IL-1β及TNF-α水平出现显著下降(P<0.05)。(3)HE染色：SAP组胰腺及回肠组织坏死严重，可见大量白细胞浸润。大黄附子汤治疗组胰腺及回肠组织轻度坏死，可见少量中性粒细胞等白细胞浸润。(4)免疫组化染色：SAP组与对照组相比GP2表达降低(P<0.05)；相较于SAP组，大黄附子汤治疗组GP2的表达水平升高(P<0.05)。

结论

大黄附子汤治疗可改善作为肠道免疫应答起始的M细胞数量与功能，增强肠道免疫应答，减轻肠免疫屏障损伤，减少内毒素入血，改善SAP症状。

关键词: 重症急性胰腺炎, M细胞, 肠黏膜免疫屏障, 大黄附子汤

Objective

To study the effect of Da-Huang-Fu-Zi-Tang on the changes of intestinal microfold cells (M cells) in mice with severe acute pancreatitis (SAP), so as to provide a theoretical basis for the clinical prevention of SAP.

Methods

Forty healthy SPF C57BL/6J male mice were selected and randomly divided into 4 groups (n=10): blank group, Da-Huang-Fu-Zi-Tang control group, SAP group, Da-Huang-Fu-Zi-Tang treatment group; the experimental group were injected with 20% PH 7.0 L-arginine into the abdominal cavity at a dose of 3.5 g/kg, and the control group were injected with the same amount of normal saline into the abdominal cavity, blank control Group and SAP group were given saline 0.2 mL by enema at 12, 24 and 36 hours after modeling, and the Da-Huang-Fu-Zi-Tang control group and treatment group were given Da-Huang-Fu-Zi-Tang 0.2 mL by enema correspondingly. At 48 hours after modeling, mice were executed and selected. Serum amylase, endotoxin, IL-1t, and TNF-nlasecuted and selected.er modelingnd treatment group were given Da-Huang-Fu-Zi-Tang, and the pathology of the pancreas was analyzed using the modified Schmidt scoring, Chiu’s intestinal mucosal injury scoring criteria were used to histologically score the ileum, and the ileum was taken for immunohistochemical staining to detect GP2 changes, which is a specific protein of M cells.

Results

The blank control group and the Da-Huang-Fu-Zi-Tang control group were generally in good condition after intraperitoneal injection, with good mental state, normal water intake, free movement of limbs, and unaffected actions. After intraperitoneal injection, the mice in the experimental group were generally in poor condition, mentally depressed, unresponsive, sluggish, shortness of breath, abdomen arched back, and reduced drinking water. The levels of amylase, endotoxin, IL-1toxins of amylasewater. l group of Da-Huang-Fu-Zi-Tang were not significantly changed compared with the blank control group (P<0.05). Compared with SAP group, serum amylase, endotoxin, IL-1toxinlaseth SAP groupr. l group of Da-Huang-Fu-Zi-Tang were not significantly changed (P<0.05). HE staining showed that the control group had normal pancreas and ileum. Necrosis of pancreas and ileum tissue was severe in SAP group, and a large number of white blood cell infiltration was seen. In the treatment group, there was mild necrosis of pancreas and ileum tissue, and a small amount of neutrophils and other white blood cells infiltrated. Immunohistochemically, compared with the blank control group, there was no significant change in the expression level of GP2 in the control group of Da-Huang-Fu-Zi-Tang; the expression of GP2 in the SAP group was lower than that of the control group (P<0.05)and the expression level of GP2 in the Tang treatment group increased (P<0.05).

Conclusions

Da-Huang-Fu-Zi-Tang can improve the number and function of M cells as the beginning of intestinal immune response, enhance intestinal immune response, reduce the damage of intestinal immune barrier, and decrease the entry of endotoxin into the blood and so as to improve SAP.

Key words: Severe Acute Pancreatitis, Microfold cells, Intestinal mucosal immune barrier, Da-Huang-Fu-Zi-Tang

表1 免疫组化评分标准

评分值	0分	1分	2分	3分	4分
阳性细胞表达(%)	0	1~25	26~50	50~75	75~100
染色强度	不着色	黄色	棕黄色	黄褐色

表1 免疫组化评分标准

评分值	0分	1分	2分	3分	4分
阳性细胞表达(%)	0	1~25	26~50	50~75	75~100
染色强度	不着色	黄色	棕黄色	黄褐色

表2 造模48 h后各组血清淀粉酶含量变化(±s)

组别	鼠数	淀粉酶含量(IU/mL)
空白对照组	10	246.03±55.32
大黄附子汤对照组	10	260.59±40.53
SAP组	10	604.49±46.39^a
大黄附子汤治疗组	10	339.47±71.66^b
F值		103.23
P值		<0.05

表2 造模48 h后各组血清淀粉酶含量变化(±s)

组别	鼠数	淀粉酶含量(IU/mL)
空白对照组	10	246.03±55.32
大黄附子汤对照组	10	260.59±40.53
SAP组	10	604.49±46.39^a
大黄附子汤治疗组	10	339.47±71.66^b
F值		103.23
P值		<0.05

表3 造模48 h后血清内毒素含量变化(±s)

组别	鼠数	内毒素含量(EU/L)
空白对照组	10	842.6±66.72
大黄附子汤对照组	10	866.3±72.20
SAP组	10	1 349.5±66.48^a
大黄附子汤治疗组	10	1 013.1±65.74^b
F值		165.53
P值		<0.05

表3 造模48 h后血清内毒素含量变化(±s)

组别	鼠数	内毒素含量(EU/L)
空白对照组	10	842.6±66.72
大黄附子汤对照组	10	866.3±72.20
SAP组	10	1 349.5±66.48^a
大黄附子汤治疗组	10	1 013.1±65.74^b
F值		165.53
P值		<0.05

表4 造模48 h后血清TNF-α和IL-1β含量变化(±s)

组别	鼠数	TNF-α含量(pg/mL)	IL-1β含量(pg/mL)
空白对照组	10	359.24±70.65	103.45±20.68
大黄附子汤对照组	10	313.35±66.67	105.12±11.06
SAP组	10	609.43±98.71^a	221.14±31.35^a
大黄附子汤治疗组	10	486.02±81.18^b	147.69±27.02^b
F值		1.83	23.56
P值		<0.05	<0.05

表4 造模48 h后血清TNF-α和IL-1β含量变化(±s)

组别	鼠数	TNF-α含量(pg/mL)	IL-1β含量(pg/mL)
空白对照组	10	359.24±70.65	103.45±20.68
大黄附子汤对照组	10	313.35±66.67	105.12±11.06
SAP组	10	609.43±98.71^a	221.14±31.35^a
大黄附子汤治疗组	10	486.02±81.18^b	147.69±27.02^b
F值		1.83	23.56
P值		<0.05	<0.05

图1 小鼠胰腺组织HE染色(400×) 注：a为空白对照组，b为大黄附子汤对照组，c为SAP组，d为大黄附子汤治疗组；与对照组相比：SAP组胰腺组织腺泡出现大面积水肿、坏死，伴大量单核巨噬细胞浸润；治疗组腺泡轻度水肿、坏死面积小，可见新生毛细血管，伴少量单核巨噬细胞浸润

表5 各组胰腺和回肠HE染色组织学评分(±s)

组别	鼠数	回肠组织学评分	胰腺组织学评分
空白对照组	10	0.65±0.28	1.56±0.25
大黄附子汤对照组	10	0.89±0.16	1.78±0.33
SAP组	10	2.36±0.56^a	12.10±0.67^a
治疗组	10	1.54±0.23^b	7.12±0.54^b
F值		17.41	411.18
P值		<0.05	<0.05

表5 各组胰腺和回肠HE染色组织学评分(±s)

组别	鼠数	回肠组织学评分	胰腺组织学评分
空白对照组	10	0.65±0.28	1.56±0.25
大黄附子汤对照组	10	0.89±0.16	1.78±0.33
SAP组	10	2.36±0.56^a	12.10±0.67^a
治疗组	10	1.54±0.23^b	7.12±0.54^b
F值		17.41	411.18
P值		<0.05	<0.05

图2 小鼠回肠组织HE染色(200×) 注：a为空白对照组，b为大黄附子汤对照组，c为SAP组，d为大黄附子汤治疗组；与对照组相比：SAP组回肠绒毛水肿变粗、上皮细胞变性、坏死甚至剥脱至肠腔，伴肠黏膜出血及炎症细胞浸润；治疗组回肠绒毛细长、略增粗，无明显上皮细胞坏死脱落，伴少量炎症细胞浸润

图3 各组回肠GP2免疫组化染色(200×) 注：a为空白对照组，b为大黄附子汤对照组，c为SAP组，d为大黄附子汤治疗组；图中黑色箭头所指棕黄色区域为GP2阳性染色；大黄附子汤对照组与空白对照组相比：GP2表达程度无明显区别；SAP组与对照组相比：GP2表达降低；大黄附子汤治疗组与SAP组相比：GP2表达增多

表6 各组回肠免疫组化染色评分(±s)

分组	鼠数	评分
空白对照组	10	1.26±0.56
大黄附子汤对照组	10	1.02±0.78
SAP组	10	0.21±0.45^a
治疗组	10	0.96±0.60^b
F值		9.58
P值		<0.05

表6 各组回肠免疫组化染色评分(±s)

分组	鼠数	评分
空白对照组	10	1.26±0.56
大黄附子汤对照组	10	1.02±0.78
SAP组	10	0.21±0.45^a
治疗组	10	0.96±0.60^b
F值		9.58
P值		<0.05

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