高脂饲喂调控自噬对肠黏膜屏障应激能力的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2024.06.008

目的

基于TLR4/NF-κB信号通路介导的自噬研究高脂饲喂小鼠肠黏膜屏障应激能力的变化情况并分析其可能机制。

方法

40 只SPF 级小鼠随机分为普通对照组（NCD 组）、高脂饮食对照组（HFD 组）、普通-重症急性胰腺炎组（NSAP 组）和高脂饮食-重症急性胰腺炎组（HSAP 组），每组10只。NCD 组予以普通饲料喂养，HFD 组予以高脂饲料喂养，共8 周。NSAP 组、HSAP 组腹腔注射20%L-精氨酸（L-Arg）（3.5 g/kg 间隔1 h，共2 次）作为应激刺激，NCD 组、HFD 组腹腔注射等量等渗盐水。ELISA法检测血清TC、TG、AMY、LPS、IL-6、TNF-α的含量；HE染色观察胰腺、结肠和肺组织病理变化；免疫组化法观察结肠上皮紧密连接蛋白Claudin、ZO-1 和Occludin 及自噬相关蛋白LC3Ⅱ及通路相关蛋白TLR4 和NF-kB 的分布；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测结肠Claudin、ZO-1、Occludin、TLR4、NF-kB 及LC3Ⅱ的表达水平。

结果

与NCD 组相比，HFD 组小鼠体重及血清中TG、TC 水平明显增高；给予20%L-Arg刺激后，与NCD相比，NSAP组血清AMY、TNF-α、LPS和IL-6含量显著升高（P＜0.05），结肠Claudin、Occludin、ZO-1 蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），TLR4、NF-κB 蛋白表达显著增加（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表达明显减少（P＜0.05）；与NSAP 组相比，HSAP 组小鼠体重及血清中TG、TC、AMY、TNF-α、LPS 和IL-6 含量明显升高（P＜0.05），结肠Claudin、Occludin、ZO-1 表达显著下降（P＜0.05），同时结肠TLR4、NF-κB 蛋白表达显著增加，结肠LC3II 蛋白表达明显减少（P＜0.05）。

结论

高脂饲喂小鼠肠黏膜屏障应激能力减弱，可能与TLR4/NF-κB信号通路介导的自噬相关。

关键词: 自噬, 高脂饮食, 肠上皮紧密连接, 肠黏膜屏障, NF-κB

Objective

To investigate the potential mechanism of intestinal mucosal barrier injury caused by intestinal epithelial cell autophagy in high-fat-diet fed mice.

Methods

Forty specific pathogenfree mice were randomly divided into normal control group （NCD group）， high fat diet group （HFD group），normal severe acute pancreatitis group （NSAP group）， and high fat diet plus severe acute pancreatitis group（HSAP group），with 10 mice in each group.The normal control group was fed with normal diet，and the highfat diet group was fed with high - fat diet for 8 weeks. Mice in the NSAP and HSAP groups were intraperitoneally injected with 20% L-arginine （L-Arg）（3.5 g/kg， 1 hour interval， 2 times in total） as a stress stimulus， while rats in the NCD and HFD groups were intraperitoneally injected with the same amount of normal saline. ELISA method was used to detect the serum TC， TG， AMY， LPS， IL-6， the content of TNF-α.HE staining was used to observe the pancreas， colon and lung tissue pathological changes.Immunohistochemistry was used to observe the distribution of tight junction proteins Claudin， ZO -1，Occludin， autophagy-related protein LC3 Ⅱ， and pathway-related proteins TLR4 and NF-kB in colon epithelium.Western Blot was used to detect the expression levels of Claudin，ZO-1，Occludin，TLR4，NF-kB and LC3Ⅱin colon.

Results

Compared with NCD group， HFD mice body weight and serum TG， TC level increased obviously.After 20%L-Arg stimulation，compared with NCD group，the levels of serum AMY，TNF-α，LPS and IL-6 in NSAP group were significantly increased （P＜0.05）， and the expression levels of colon Claudin，Occludin and ZO-1 protein were significantly decreased （P＜0.05）.TLR4，NF-κB protein expression significantly increased （P＜0.05）， LC3II protein expression decreased significantly （P＜0.05）. Compared with the NSAP group，the body weight and serum levels of TG，TC，AMY，TNF-α，LPS and IL-6 in the HSAP group were significantly increased （P＜0.05）， and the expression of Claudin， Occludin and ZO-1 in the colon was significantly decreased （P＜0.05）. At the same time， the expression of TLR4 and NF-κB protein in the colon was significantly increased， and the expression of LC3II protein in the colon was significantly decreased （P＜0.05）.

Conclusions

High-fat diet reduces the ability of intestinal mucosal barrier stress in mice， and the mechanism may be related to the regulation of TLR4/NF-κB signaling pathway mediated autophagy.

Key words: High-fat diet, Autophagy, Intestinal epithelial tight junction, Intestinal mucosal barrier, Nuclear factor-kappa B

图1 各组小鼠体重变化情况柱状图

表1 各组小鼠体重变化情况（±s）

组别	只数	第1周初始体重（g）	8周末次体重（g）	末次体重平均值
NCD组	10	15.81±0.51	29.48±1.36	29.09±1.32^a
NSAP组	10	16.42±0.34	28.70±1.26
HFD组	10	16.31±0.50	35.74±1.03	35.15±1.11^b
HSAP组	10	15.98±0.57	34.56±1.21
F值		1.63	2.24	2.11

表1 各组小鼠体重变化情况（±s）

组别	只数	第1周初始体重（g）	8周末次体重（g）	末次体重平均值
NCD组	10	15.81±0.51	29.48±1.36	29.09±1.32^a
NSAP组	10	16.42±0.34	28.70±1.26
HFD组	10	16.31±0.50	35.74±1.03	35.15±1.11^b
HSAP组	10	15.98±0.57	34.56±1.21
F值		1.63	2.24	2.11

图2 各组血清TC和TG含量比较

表2 各组血清TC和TG含量变化（±s）

组别	只数	TC（mmol/L）	TG（mmol/L）
NCD组	10	3.19±0.35	5.68±1.31
NSAP组	10	4.04±1.51^a	6.59±1.34^a
HFD组	10	7.89±1.71^b	9.67±1.43^b
HSAP组	10	11.16±1.25^c	12.04±1.12^c
F值		78.65	49.92

表2 各组血清TC和TG含量变化（±s）

组别	只数	TC（mmol/L）	TG（mmol/L）
NCD组	10	3.19±0.35	5.68±1.31
NSAP组	10	4.04±1.51^a	6.59±1.34^a
HFD组	10	7.89±1.71^b	9.67±1.43^b
HSAP组	10	11.16±1.25^c	12.04±1.12^c
F值		78.65	49.92

图3 各组血清AMY、TNF-α、LPS和IL-6含量比较（±s）注：a为AMY，b为TNF-α，c为LPS，d为IL-6

表3 各组血清AMY、TNF-α、LPS和IL-6含量变化（±s）

组别	只数	AMY（ng/mL）	TNF-α（pg/mL）	LPS（EU/L）	IL-6（pg/mL）
NCD组	10	210.64±30.52	235.34±35.24	580.34±22.38	100.03±12.34
NSAP组	10	436.65±25.49^a	498.54±22.24^a	1123.54±31.94^a	168.84±32.36^a
HFD组	10	257.72±45.51^b	305.31±34.45^b	733.51±22.71^b	137.59±19.75^b
HSAP组	10	601.33±38.72^c	718.12±29.12^c	1321.12±25.32^c	321.43±43.28^c
F值		247.91	497.81	1 747.32	108.99

表3 各组血清AMY、TNF-α、LPS和IL-6含量变化（±s）

组别	只数	AMY（ng/mL）	TNF-α（pg/mL）	LPS（EU/L）	IL-6（pg/mL）
NCD组	10	210.64±30.52	235.34±35.24	580.34±22.38	100.03±12.34
NSAP组	10	436.65±25.49^a	498.54±22.24^a	1123.54±31.94^a	168.84±32.36^a
HFD组	10	257.72±45.51^b	305.31±34.45^b	733.51±22.71^b	137.59±19.75^b
HSAP组	10	601.33±38.72^c	718.12±29.12^c	1321.12±25.32^c	321.43±43.28^c
F值		247.91	497.81	1 747.32	108.99

图4 各组胰腺组织病理（HE染色×400）

图5 各组结肠组织病理（HE染色×400）

图6 各组小鼠肺组织病理（HE染色×400）

表4 各组胰腺、肺、结肠组织病理学评分（±s）

组别	只数	胰腺组织病理评分（分）	结肠组织病理评分（分）	肺组织病理评分（分）
NCD组	10	0.32±0.41	0.45±0.33	0.31±0.21
NSAP组	10	6.65±1.25^a	7.45±1.46^a	6.25±1.05^a
HFD组	10	0.48±1.45^b	0.63±1.23^b	0.41±1.15^b
HSAP组	10	9.74±1.21^c	10.43±1.11^c	8.64±1.23^c
F值		164.99	200.62	179.66

表4 各组胰腺、肺、结肠组织病理学评分（±s）

组别	只数	胰腺组织病理评分（分）	结肠组织病理评分（分）	肺组织病理评分（分）
NCD组	10	0.32±0.41	0.45±0.33	0.31±0.21
NSAP组	10	6.65±1.25^a	7.45±1.46^a	6.25±1.05^a
HFD组	10	0.48±1.45^b	0.63±1.23^b	0.41±1.15^b
HSAP组	10	9.74±1.21^c	10.43±1.11^c	8.64±1.23^c
F值		164.99	200.62	179.66

图7 各组结肠Claudin、ZO-1、Occludin、TLR4，NF-κB和LC3II免疫组化表达AOD值（±s）注：a为Claudin、ZO-1、Occludin的AOD值，b为TLR4，NF-κB和LC3II达的AOD值

图8 各组结肠组织Claudin、ZO-1、Occludin、TLR4、NF-κB、LC3II分布及定位（免疫组化染色×400）

表5 各组结肠Claudin、ZO-1、Occludin、TLR4、NF-κB、LC3II 免疫组化表达AOD值（±s）

组别	只数	Claudin	Occludin	ZO-1	TLR4	NF-κB	LC3II
NCD组	10	0.35±0.05	0.45±0.06	0.51±0.02	0.16±0.04	0.18±0.06	0.38±0.03
NSAP组	10	0.18±0.02^a	0.23±0.01^a	0.25±0.04^a	0.24±0.02^a	0.27±0.05^a	0.19±0.04^a
HFD组	10	0.23±0.05^b	0.33±0.10^b	0.34±0.06^b	0.35±0.06^b	0.31±0.07^b	0.23±0.05^b
HSAP组	10	0.12±0.02^c	0.18±0.03^c	0.11±0.04^c	0.51±0.03^c	0.50±0.02^c	0.16±0.02^c
F值		65.75	38.97	156.06	141.33	63.74	70.62

表5 各组结肠Claudin、ZO-1、Occludin、TLR4、NF-κB、LC3II 免疫组化表达AOD值（±s）

组别	只数	Claudin	Occludin	ZO-1	TLR4	NF-κB	LC3II
NCD组	10	0.35±0.05	0.45±0.06	0.51±0.02	0.16±0.04	0.18±0.06	0.38±0.03
NSAP组	10	0.18±0.02^a	0.23±0.01^a	0.25±0.04^a	0.24±0.02^a	0.27±0.05^a	0.19±0.04^a
HFD组	10	0.23±0.05^b	0.33±0.10^b	0.34±0.06^b	0.35±0.06^b	0.31±0.07^b	0.23±0.05^b
HSAP组	10	0.12±0.02^c	0.18±0.03^c	0.11±0.04^c	0.51±0.03^c	0.50±0.02^c	0.16±0.02^c
F值		65.75	38.97	156.06	141.33	63.74	70.62

图9 各组结肠组织Claudin、ZO-1、Occludin表达Western-blot检测结果及其AOD值注：a为Claudin、ZO-1、Occludin表达Western-blot检测结果，b为其AOD值

图10 结肠组织TLR4、NF-κB和LC3II的Western-blot检测结果表达情况及其AOD值注：a为结肠组织TLR4、NF-κB和LC3II的Western-blot检测结果表达，b为其AOD值

［1］	Ferris RL， Darling S， Pesavento PA， et al.Hyperlipidemia and xanthomatosis in yellow - footed rock wallabies （petrogale xanthopus） under managed care［J］. J Zoo Wildl Med， 2022， 53（2）：470-479.
［2］	Campbell KJ， Hesketh KD. Strategies which aim to positively impact on weight， physical activity， diet and sedentary behaviours in children from zero to five years. A systematic review of the literature［J］.Obes Rev，2007，8（4）：327-338.
［3］	Günzel D， Yu AS.Claudins and the modulation of tight junction permeability［J］.Physiol Rev，2013，93（2）：52569.
［4］	Li J， Xie Y， Zheng S， et al. Targeting autophagy in diabetic cardiomyopathy： from molecular mechanisms to pharmacotherapy［J］.Biomed Pharmacother，2024（175）：116790.
［5］	Randall-Demllo S， Chieppa M， Eri R. Intestinal epithelium and autophagy： partners in gut homeostasis［J］. Front Immunol， 2013（4）：301.
［6］	Li Y， Cheng Y， Zhou Y， et al. High fat diet-induced obesity leads to depressive and anxiety-like behaviors in mice via AMPK/mTOR-mediated autophagy［J］.Exp Neurol，2022（348）：113949.
［7］	Su YR， Hong YP， Mei FC， et al. High-fat diet aggravates the intestinal barrier injury via TLR4-RIP3 pathway in a rat model of severe acute pancreatitis［J］. Mediators Inflamm， 2019（2019）：2512687.
［8］	梁宇晗，王洪双，何慧彬，等.基于细胞自噬调控的中药治疗溃疡性结肠炎药理机制研究进展［J］. 环球中医药， 2024， 17（3）：544-550.
［9］	Narayanan KB，Park HH.Toll/interleukin-1 receptor（TIR）domainmediated cellular signaling pathways［J］. Apoptosis， 2015， 20（2）：196-209.
［10］	孙丽薇，耿倩，郑国华.肠道菌群-肠-脑-肌轴信号交流的研究进展［J］.微生物学报，2024，64（5）：1364-1377.
［11］	Xia H，Guo J，Shen J，et al.Ketogenic diet exacerbates l-arginineinduced acute pancreatitis and reveals the therapeutic potential of butyrate［J］.Nutrients，2023，15（20）：4427.
［12］	Chen L， Lei Y， Lu C， et al. Punicic acid ameliorates obesityrelated hyperlipidemia and fatty liver in mice via regulation of intestinal flora and lipopolysaccharide-related signaling pathways［J］.Food Funct，2024，15（9）：5012-5025.
［13］	马德亮.重症急性胰腺炎中肠上皮铁死亡对肠粘膜屏障损伤和细菌易位的影响［D］.青岛：青岛大学，2021.
［14］	贾骐瑄，王猛，秦雨，等.中医药调控自噬维持肠黏膜屏障的研究进展［J］.中国中西医结合外科杂志，2023，29（2）：276-282.
［15］	郭帅，路晓光，战丽彬，等.大黄附子汤对大鼠失血性休克复苏后肠黏膜屏障的保护作用［J/CD］. 中华卫生应急电子杂志，2016，2（1）：37-42.
［16］	Levine B， Mizushima N， Virgin HW. Autophagy in immunity and inflammation［J］.Nature，2011，469（7330）：323-335.
［17］	Yang S， Bing M， Chen F， et al. Autophagy regulation by the nuclear factor κB signal axis in acute pancreatitis［J］. Pancreas，2012，41（3）：367-373.
［18］	Kawai T， Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity： update on Toll-like receptors［J］. Nat Immunol，2010，11（5）：373-384.
［19］	Naama M， Bel S. Autophagy-ER stress crosstalk controls mucus secretion and susceptibility to gut inflammation［J］. Autophagy，2023，19（11）：3014-3016.
［20］	Zhou M， Xu W， Wang J， et al. Boosting mTOR - dependent autophagy via upstream TLR4-MyD88-MAPK signalling and downstream NF-κB pathway quenches intestinal inflammation and oxidative stress injury［J］.EBioMedicine，2018（35）：345-360.
［21］	Li YY， Ishihara S， AzIz MM， et al. Autophagy is required for tolllike receptor-mediated interleukin- 8 production in intestinal epithelial cells［J］.Int J Mol Med，2011，27（3）：337-344.
［22］	Dong J， Ji B， Jiang Y， et al. Autophagy activation alleviates the LPS - induced inflammatory response in endometrial epithelial cells in dairy cows［J］.Am J Reprod Immunol，2024，91（2）：e13820.
［23］	Gukovskaya AS， Gukovsky I， Algül H， et al. Autophagy，inflammation， and immune dysfunction in the pathogenesis of pancreatitis［J］.Gastroenterology，2017，153（5）：1212-1226.
［24］	郭文秀.基于肠道菌群和代谢产物探讨大黄附子汤治疗高脂血症性重症急性胰腺炎的机理［D］. 沈阳：辽宁中医药大学，2024.
［25］	袁小凌，刘洁，杨淑丽，等.3-MA和PDTC联合应用对大鼠急性坏死性胰腺炎的协同保护作用［J］.胃肠病学，2013，18（2）：76-81.
［26］	罗涵，郭平，周其全.TLR4/NF-κB 在低氧暴露下大鼠肠道粘膜屏障功能损伤及细菌移位中的作用研究［C］//第十三届中国体视学与图像分析学术会议论文集，2013：146-155.
［27］	张发仁，许丽艳，沈忠英，等.自噬的概述［J］.汕头大学医学院学报，2005，18（4）：250-253.
［28］	Tenner S， Vege SS， Sheth SG， et al. American college of gastroenterology guidelines： management of acute pancreatitis［J］.Am J Gastroenterol，2024（3）：119.
［29］	李宜醒，姚伟静，易聪.细胞自噬研究进展［J］.中国细胞生物学学报，2019，41（2）：192-201.

[1]	王峰, 曲更宝, 王文彦, 代艳亭. 罗汉果醇对人乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响[J/OL]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2025, 19(01): 27-32.
[2]	张刚, 秦勇, 黄超, 薛震, 吕松岑. 基于骨关节炎软骨细胞表型转化的新兴治疗靶点[J/OL]. 中华关节外科杂志(电子版), 2024, 18(03): 352-362.
[3]	吴杰, 周志强, 符菁, 李喜功, 张钦. 吸入性氢气对大鼠脊髓损伤后自噬及神经功能的影响[J/OL]. 中华危重症医学杂志(电子版), 2024, 17(05): 363-371.
[4]	许彬, 王丽, 陈瑞, 沈奕, 陆件. 瞬时受体电位粘脂素1介导细胞自噬在远端缺血后处理保护大鼠脑缺血-再灌注损伤中的作用研究[J/OL]. 中华危重症医学杂志(电子版), 2024, 17(03): 180-187.
[5]	李争光, 宰爽嘉, 吴火峰, 孙华, 张永博, 陈浏阳, 戴睿, 张亮. 昼夜节律相关因子在椎间盘退行性变发病机制中作用的研究进展[J/OL]. 中华损伤与修复杂志(电子版), 2024, 19(05): 457-461.
[6]	廖泽楷, 梁爱琳, 龚启梅. 根尖周病中程序性细胞死亡的研究进展[J/OL]. 中华口腔医学研究杂志(电子版), 2024, 18(03): 150-155.
[7]	陈浩, 林梁, 邹来宾, 郭胜蓝. 成石饮食诱发胆结石及肝损伤机制的研究[J/OL]. 中华普通外科学文献(电子版), 2025, 19(01): 42-47.
[8]	王刚, 李涛, 刘玉芳. 胃癌根治手术后行抗菌药物治疗对患者肠道细菌移位及肠黏膜屏障功能的影响[J/OL]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2024, 18(02): 141-145.
[9]	季加翠, 孙春斌, 罗恩丽. 姜黄素通过调节NF-κB/NLRP3通路减轻LPS诱导小胶质细胞神经炎症损伤[J/OL]. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2024, 14(04): 193-203.
[10]	何婧, 张海涛, 邵琦妍, 吴彬阁. 硫柳汞对结膜上皮细胞自噬调控及水杨酸钠对其保护机制的实验研究[J/OL]. 中华眼科医学杂志(电子版), 2024, 14(06): 346-350.
[11]	史清泉, 苗彬, 王烁, 陶琳, 沈晨. miR-181a-5p 靶向ATG5 抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J自噬的机制研究[J/OL]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2024, 14(06): 524-530.
[12]	陈惠英, 邱敏珊, 邵汉权. 脓毒症诱发肠黏膜屏障功能损伤的风险因素模型构建与应用效果[J/OL]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2024, 14(05): 448-452.
[13]	于伟伟, 张国高, 吴军, 胡俊, 黄一宁, 徐晶. 线粒体相关内质网膜相关线粒体功能障碍在阿尔茨海默病中的研究进展[J/OL]. 中华临床医师杂志(电子版), 2024, 18(02): 223-230.
[14]	刘霖, 张文欢, 宋雅茹, 姜云璐. Apelin-13 在阿尔茨海默病中的神经保护作用机制研究进展[J/OL]. 中华诊断学电子杂志, 2024, 12(04): 276-280.
[15]	徐凤华, 喻丽玲, 路晓光, 王迎莉, 宋轶. 高脂饲喂小鼠结肠ILC3s变化对肠屏障应激能力的影响[J/OL]. 中华卫生应急电子杂志, 2024, 10(02): 107-114.

阅读次数

全文

摘要

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Effects of high-fat diet on intestinal mucosal barrier stress via autophagy regulation

模态框（Modal）标题

选择文件类型/文献管理软件名称

选择包含的内容

Effects of high-fat diet on intestinal mucosal barrier stress via autophagy regulation